支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中常見且隱蔽的污染物，其直徑僅0.2-0.3μm，可穿透常規(guī)濾膜，且初期無明顯肉眼特征（如培養(yǎng)液渾濁、pH驟變），易被忽視，但會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢、形態(tài)異常、基因表達(dá)紊亂，甚至直接影響實驗結(jié)果可靠性。針對細(xì)胞支原體污染，需重點關(guān)注以下7個核心要點：  

一、污染前：預(yù)防是關(guān)鍵，從源頭阻斷風(fēng)險  

嚴(yán)格把控“入口關(guān)”  

細(xì)胞來源需可靠：優(yōu)先從正規(guī)細(xì)胞庫（如ATCC、中國科學(xué)院細(xì)胞庫）獲取細(xì)胞，接收后第一時間進(jìn)行支原體檢測（不可依賴“外觀判斷”），確認(rèn)陰性后再傳代培養(yǎng)；  

試劑滅菌要干凈：培養(yǎng)基、血清、胰酶等需經(jīng)0.1μm濾膜過濾（普通0.22μm濾膜無法截留支原體），且避免反復(fù)凍融；PBS、培養(yǎng)液等開封后建議短期內(nèi)使用，存放時密封避光，防止交叉污染。  

規(guī)范操作流程，減少人為污染  

實驗前需對超凈臺進(jìn)行30分鐘以上紫外消毒，操作時戴無菌手套并頻繁更換，避免手觸碰到吸管、培養(yǎng)瓶瓶口等關(guān)鍵部位；  

不同細(xì)胞系操作時需更換移液器吸頭、培養(yǎng)液，避免“共用耗材”導(dǎo)致交叉污染；若懷疑某細(xì)胞可能污染，需最后處理該細(xì)胞，且操作后單獨消毒超凈臺。  

環(huán)境與耗材雙重防護(hù)  

定期清潔培養(yǎng)箱：每周用70%乙醇擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁、隔板，每月更換培養(yǎng)箱內(nèi)的水盤（加入含抗生素的無菌水，抑制支原體滋生）；  

選用無支原體耗材：購買標(biāo)注“無支原體認(rèn)證”的培養(yǎng)瓶、離心管、吸頭，避免使用反復(fù)清洗的玻璃耗材（易殘留支原體）。  

二、污染中：及時檢測+科學(xué)處理，避免擴散  

盡早精準(zhǔn)檢測，避免“隱性延誤”  

推薦使用高靈敏度檢測方法：常規(guī)PCR法（檢測支原體特異性基因）、熒光染色法（觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色點狀熒光）或商業(yè)化支原體檢測試劑盒，建議每1-2周對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行一次抽檢，尤其是傳代次數(shù)多、來源復(fù)雜的細(xì)胞；  

避免“經(jīng)驗判斷誤區(qū)”：若細(xì)胞出現(xiàn)生長速率下降、貼壁能力減弱、形態(tài)皺縮（如上皮細(xì)胞變梭形），即使培養(yǎng)液清澈，也需優(yōu)先排查支原體，而非僅歸因于“細(xì)胞狀態(tài)差”。  

污染細(xì)胞處理：分類處置，防止擴散  

非關(guān)鍵細(xì)胞：直接丟棄（用含10%次氯酸鈉的溶液浸泡培養(yǎng)瓶30分鐘后再處理），避免試圖“挽救”導(dǎo)致污染擴散；  

珍貴細(xì)胞：若需挽救，可采用支原體清除試劑（如支原體去除劑、抗生素組合，需注意選擇對細(xì)胞毒性低的產(chǎn)品），處理后連續(xù)檢測3代以上，確認(rèn)支原體陰性且細(xì)胞形態(tài)、功能正常，方可恢復(fù)使用；期間需單獨隔離培養(yǎng)，避免與其他細(xì)胞接觸。  

三、污染后：復(fù)盤溯源+長期監(jiān)控，杜絕復(fù)發(fā)  

追溯污染源頭，針對性改進(jìn)  

排查可能的污染途徑：回顧近期操作（如是否使用過未經(jīng)檢測的血清、是否交叉使用過耗材）、環(huán)境（如培養(yǎng)箱是否曾維修、超凈臺是否有氣流異常）、人員（如是否有新操作者加入），找到源頭后及時調(diào)整（如更換血清批次、重新校準(zhǔn)超凈臺）；  

記錄污染事件：詳細(xì)記錄污染細(xì)胞系、時間、檢測結(jié)果、處理方式，建立“細(xì)胞污染檔案”，便于后續(xù)追溯和預(yù)防。  

建立長期監(jiān)控體系，形成閉環(huán)管理  

定期“全面篩查”：除單批細(xì)胞抽檢外，每3個月對實驗室所有在培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行一次支原體普查，同時檢測培養(yǎng)箱環(huán)境、常用試劑（如血清留樣），確保無“潛伏污染”；  

人員培訓(xùn)常態(tài)化：定期開展細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范培訓(xùn)，強調(diào)支原體污染的危害與防控細(xì)節(jié)（如濾膜選擇、操作手勢），避免因操作不規(guī)范導(dǎo)致反復(fù)污染。